T細(xì)胞耗竭是在慢性感染和癌癥的長期刺激下，T細(xì)胞喪失功能的狀態(tài)。其主要表現(xiàn)為：增殖能力降低，抑制性受體（Inhibitory receptors，IRs）持續(xù)高表達(dá)，以及效應(yīng)細(xì)胞因子減少等特征，其轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳進(jìn)程均被改變。無法持久地逆轉(zhuǎn)CD8 T細(xì)胞衰竭仍然是治療癌癥和慢性感染的主要障礙。更好地了解誘導(dǎo)和維持衰竭的分子線索將有助于開發(fā)更有效的治療方法來預(yù)防或逆轉(zhuǎn)這種狀態(tài)。體內(nèi)模型已經(jīng)產(chǎn)生了關(guān)于Tex的基礎(chǔ)知識，但產(chǎn)生的細(xì)胞產(chǎn)量低，耗時，昂貴，難以規(guī)?；?。因此，這些系統(tǒng)對于高通量篩選方法來說并不理想。
美國賓夕法尼亞大學(xué)的E.John Wherry團(tuán)隊多年來致力于T細(xì)胞耗竭相關(guān)研究，今日該團(tuán)隊在Science Immunology雜志發(fā)表題為In vitro modeling of CD8+ T cell exhaustion enables CRISPR screening to reveal a role for BHLHE40的文章，他們通過體外慢性刺激，構(gòu)建了CD8 T細(xì)胞耗竭的模型，并以體內(nèi)Tex模型為基準(zhǔn)，對該體外模型從分子表型，轉(zhuǎn)錄水平和表觀遺傳水平評估，證明其體現(xiàn)了多種體內(nèi)Tex的特征，然后通過對體外模型的CRISPR高通量測序，篩選出轉(zhuǎn)錄因子BHLHE40調(diào)控T細(xì)胞耗竭進(jìn)程。

研究人員將P14 CD8 T細(xì)胞（特異性識別LCMV D^bGP^33-41表位的TCR）與D^bGP^33-41刺激的C57BL/6小鼠脾樹突狀細(xì)胞(DC)共培養(yǎng)，在第0天使用D^bGP^33-41多肽刺激后，慢性刺激模型每兩天使用D^bGP^33-41和IL-2刺激，而急性模型僅加入IL-2。結(jié)果表明，慢性模型中細(xì)胞增殖受到抑制，且凋亡敏感性增加。雖然急性模型中IRs升高，但隨時間減弱，而慢性模型中IRs表達(dá)更高，且持續(xù)表達(dá)。而慢性模型中的多種效應(yīng)因子也更低，但仍高于體內(nèi)Tex。
隨后，研究人員針對體外耗竭模型進(jìn)行測序，以探究其轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳特征。RNA-seq結(jié)果顯示，在d4時，慢性模型和急性模型定位一致，差異基因僅有634個，而在d7時差異基因達(dá)到2844個，表明二者具有相似的起始進(jìn)程，而是在d7時發(fā)生分化，其中急性刺激P14細(xì)胞偏向于Tmem表型，而急性模型中則偏向Tex表型?；蚋患治鲋?，體內(nèi)Tex上調(diào)的基因在慢性模型的P14細(xì)胞中傾向富集，這些基因與T細(xì)胞激活的負(fù)調(diào)控相關(guān)。在針對表觀遺傳特征的ATAC-seq檢測中，兩模型中的P14細(xì)胞在d4均與Tex共定位，可能是與相關(guān)染色質(zhì)可及性的激活有關(guān)。與轉(zhuǎn)錄水平一致的是，二者均表現(xiàn)出相似的初始途徑，以及在d7出現(xiàn)分化。

在證明體外慢性刺激模型可以體現(xiàn)體內(nèi)Tex的特征后，研究人員通過CRISPR篩選，希望可以找出調(diào)控Tex進(jìn)程的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果顯示，BHLHE40在慢性模型中高頻表達(dá)，并且在急性模型中并未出現(xiàn)，提示其可能與T細(xì)胞耗竭密切相關(guān)。研究人員通過shRNA敲低BHLHE40的方法，發(fā)現(xiàn)PD-1、Tim3等多種IRs下調(diào)，提示其可能促進(jìn)IRs的表達(dá)。為測試BHLHE40在體內(nèi)調(diào)節(jié)CD8 T細(xì)胞的功能，研究人員將BHLHE40 shRNA KD的P14細(xì)胞轉(zhuǎn)入急性和慢性感染的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)慢性感染的小鼠中BHLHE40敲低細(xì)胞有更強的增殖優(yōu)勢，而在急性模型中并未表現(xiàn)。而且在d31時，BHLHE40敲低細(xì)胞中部分IRs表達(dá)降低。同時，流式檢測結(jié)果則表明，BHLHE40敲低促進(jìn)了P14細(xì)胞從Tex中期細(xì)胞向Tex祖細(xì)胞的分化。


綜上所述，本研究建立了一種體外T細(xì)胞耗竭模型，可以在很大程度上還原體內(nèi)T細(xì)胞耗竭的特征，雖然不能完全模擬體內(nèi)T細(xì)胞耗竭狀態(tài)，但仍可用于高通量測序等研究，并因此發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BHLHE40在T細(xì)胞耗竭的進(jìn)程中扮演重要的角色。

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