腫瘤細(xì)胞免疫療法--CAR-NK和CAR-M細(xì)胞療法
免疫系統(tǒng)中的T細(xì)胞可以靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，而T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞依賴于對(duì)腫瘤抗原的特異性識(shí)別。但T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）識(shí)別腫瘤抗原的模式受到人類白細(xì)胞抗原（human Leukocyte antigen，HLA）分子的限制，且面對(duì)腫瘤細(xì)胞HLA分子表達(dá)的下調(diào)以及免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，TCR很難激活T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。為了突破HLA分子的限制，一種工程化改造的分子——嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）誕生了。CAR的結(jié)構(gòu)類似于TCR，由胞外特異性腫瘤抗原識(shí)別區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激域以及胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域五部分組成。胞外特異性腫瘤抗原識(shí)別區(qū)可由抗體單鏈可變區(qū)（針對(duì)腫瘤抗原特異性抗體的重鏈和輕鏈）或納米抗體組成，能夠以非HLA分子限制的模式直接識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原或者特異性抗原，并通過胞內(nèi)信號(hào)域傳導(dǎo)信號(hào)、活化效應(yīng)T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)特異性殺傷腫瘤的效果[1]。
將這種針對(duì)腫瘤特異性抗原或者腫瘤相關(guān)抗原的CAR通過基因工程的方法表達(dá)于T細(xì)胞表面，并經(jīng)體外擴(kuò)增后過繼輸注給相應(yīng)腫瘤患者的療法稱之為CAR-T細(xì)胞免疫療法，而表達(dá)了CAR分子的T細(xì)胞被稱為CAR-T細(xì)胞（圖1）[2]。除T細(xì)胞外，CAR也能表達(dá)于其他免疫細(xì)胞表面，如自然殺傷細(xì)胞（Natural Killer cells，NK）、巨噬細(xì)胞（Macrophage）、γδT細(xì)胞、DC細(xì)胞等免疫細(xì)胞，這對(duì)應(yīng)的就是CAR-NK細(xì)胞、CAR-M細(xì)胞、CAR-γδT細(xì)胞、CAR-DC細(xì)胞。
近些年，CAR-T療法在惡性腫瘤的治療上取得了顯著成就，尤其是在血液瘤的治療上表現(xiàn)出了極佳的治療效果，被認(rèn)為是最有希望治愈腫瘤的治療方法之一。目前利用CAR-T技術(shù)治療的血液系統(tǒng)腫瘤包括急性髓系白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等，并且在治療肝癌、前列腺癌等實(shí)體瘤中也具有一定的效果。截止2023年9月，全球共上市了9款CAR-T治療藥物，靶點(diǎn)為CD19和BCMA，主要用于治療血液腫瘤。其中，據(jù)吉利德2023年前三季度財(cái)報(bào)統(tǒng)計(jì)，Yescarta（Anti-CD19 CAR-T）和Tecartus（Anti-CD19 CAR-T）兩款細(xì)胞產(chǎn)品銷售額達(dá)到14.02億美金（合計(jì)約102億人民幣），其市場(chǎng)潛力可見一斑。
但其目前也存在一些挑戰(zhàn)與不足。其一是臨床治療安全性問題，CAR-T療法在臨床容易出現(xiàn)細(xì)胞毒副作用，最常見的CAR-T細(xì)胞的毒副作用為細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS）［3］。嚴(yán)重的CRS和ICANS 有致命風(fēng)險(xiǎn)，因此如何提高CAR-T療法的安全性，降低細(xì)胞毒副作用，成為了細(xì)胞藥物研發(fā)亟需解決的問題。其二是由于多方面的原因[4]（詳見前期推文），CAR-T療法在實(shí)體腫瘤的治療上效果不甚理想。第三則是由于目前CAR-T療法為個(gè)體化定制治療，產(chǎn)能受限，費(fèi)用高昂，大多數(shù)國(guó)內(nèi)患者無法支付。
基于自體CAR-T療法在實(shí)體瘤中所面臨的的種種問題，人們迫切期待一種可以通用的、現(xiàn)貨型的、可以大規(guī)模制備的細(xì)胞治療產(chǎn)品出現(xiàn)，而CAR-NK療法，或?qū)閷?shí)現(xiàn)這一目標(biāo)帶來希望。
三、CAR-NK療法
自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）來源于骨髓淋巴樣干細(xì)胞，占成人外周血淋巴細(xì)胞的5%~15%，是重要的固有免疫細(xì)胞，因其非專一性的細(xì)胞毒作用而被命名。NK細(xì)胞在腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其通過直接溶解和分泌細(xì)胞因子等作用殺傷腫瘤細(xì)胞，因此開發(fā)它的抗癌功能是近年來癌癥研究的熱點(diǎn)。
不同于T細(xì)胞通過TCR特異性識(shí)別MHC-抗原肽復(fù)合物產(chǎn)生活化信號(hào)進(jìn)而激活的方式，NK細(xì)胞發(fā)揮殺傷靶細(xì)胞的作用無須抗原刺激、也無需抗原提呈，且不受自體MHC限制性。NK細(xì)胞表面表達(dá)復(fù)雜的受體譜，主要包括殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)、C型凝集素樣受體家族和NKp30、NKp44、NKp46等激活性自然細(xì)胞毒受體(NCR)。按其功能可分為抑制性和活化性受體，與相應(yīng)配體作用分別傳導(dǎo)抑制性和活化性信號(hào)，NK細(xì)胞的激活由2種信號(hào)間的平衡決定[5]。被激活的NK細(xì)胞通過多種機(jī)制“消滅”靶細(xì)胞細(xì)胞(如圖3)，例如：①釋放穿孔素和顆粒酶，使靶細(xì)胞裂解或凋亡；②促進(jìn)腫瘤細(xì)胞FasL表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；③釋放 TNF-α、IFN-γ、GM-CSF 和趨化因子(例如 CCL1、CCL2、CCL3等)，募集和激活其他效應(yīng)免疫細(xì)胞等。
和CAR-T療法相比，CAR-NK 療法具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：
1）CAR-NK 細(xì)胞來源廣泛（圖4），可從包括 NK92 細(xì)胞系、PBMC 和 iPSC 在內(nèi)的多種臨床樣本或商業(yè)化細(xì)胞系獲取，且 CAR-NK 細(xì)胞可以作為“現(xiàn)貨型”細(xì)胞治療產(chǎn)品[6]；
2）CAR-NK 細(xì)胞在循環(huán)中的壽命有限，因此對(duì)正常組織的靶向/脫瘤毒性風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低；
3）使用CAR-NK細(xì)胞治療后CRS風(fēng)險(xiǎn)低：不同于CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)擴(kuò)增并產(chǎn)生如IL6、IL1β等促炎因子，NK細(xì)胞主要分泌IFN-γ和GM-CSF，且在體內(nèi)數(shù)周內(nèi)不會(huì)擴(kuò)增，從而降低了CRS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；
4）CAR-NK細(xì)胞不需要進(jìn)行嚴(yán)格的HLA基因匹配：異體來源NK細(xì)胞不表達(dá)個(gè)體特異性TCR，引起移植物抗宿主?。℅VHD）的潛在風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)低于CAR-T細(xì)胞治療；
5）NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的途徑多，經(jīng)過CAR修飾的NK細(xì)胞既能夠通過 CAR依賴性的方式清除抗原特異性腫瘤，又能通過NK細(xì)胞受體依賴性機(jī)制有效根除某些不表達(dá)CAR靶向抗原的異質(zhì)性腫瘤。
表1 CAR-T與CAR-NK的對(duì)比（表格來源：西南證券）
四、CAR-M療法
巨噬細(xì)胞（M）具有高度異質(zhì)性，可塑能力強(qiáng)，有吞噬作用、抗原呈遞和浸潤(rùn)能力。巨噬細(xì)胞對(duì)抗癌癥的嘗試始于幾十年前，然而早期臨床試驗(yàn)的療效評(píng)估表明巨噬細(xì)胞移植療法效果甚微，巨噬細(xì)胞需要額外的信號(hào)來指導(dǎo)其對(duì)抗腫瘤。因此，以CAR-T/NK的發(fā)展?jié)摿椭苽溥^程作為參照模板，研究人員開始研究將單核/巨噬細(xì)胞作為細(xì)胞免疫治療的載體細(xì)胞，結(jié)合目前蓬勃發(fā)展的嵌合抗原受體技術(shù)與日漸成熟的基因工程優(yōu)化技術(shù)，從分子水平上改造單核/巨噬細(xì)胞，制備獲嵌合抗原受體-巨噬細(xì)胞(CAR-M) ，利用其高效浸潤(rùn)性，增強(qiáng)其吞噬能力及抗原遞呈能力，以應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域。CAR-M有望成為細(xì)胞免疫治療的新一代主角。
圖5 巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤示意圖
與CAR-T不同，CAR-M主要有三大優(yōu)勢(shì)：
1) 首先巨噬細(xì)胞可以輕松侵入腫瘤微環(huán)境（TME）中吞噬腫瘤細(xì)胞，影響TME中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的比例，改變TAM的表型(由M2轉(zhuǎn)變?yōu)镸1)；
2) 其次，巨噬細(xì)胞還可上調(diào)抗原呈遞機(jī)制相關(guān)分子的表達(dá)，如組織相容性復(fù)合物 II 類 （MHC-II）、CD80和CD86，可作為抗原呈遞細(xì)胞，通過交叉呈遞吞噬抗原來激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答；
3) 最后CAR-M的循環(huán)有時(shí)限，非腫瘤靶向毒性較小。
CAR-M的首次報(bào)道是在2020年，目前絕大多數(shù)研究仍處于科研階段，產(chǎn)業(yè)化還在初期階段。雖然從理論而言，CAR-M療法對(duì)實(shí)體瘤具有明顯優(yōu)勢(shì)，但還處于“嬰兒期”，要想真正加入臨床應(yīng)用，仍需克服許多困難，如：
1）來源與擴(kuò)增問題。與CAR-T/NK不同，T細(xì)胞和NK細(xì)胞可從患者體中提取而來然后可在實(shí)驗(yàn)室中大量擴(kuò)增，但巨噬細(xì)胞在體外幾乎不擴(kuò)增，大量獲取是一大難題。而永生化或腫瘤細(xì)胞系并不能良好的代表原代細(xì)胞的性質(zhì)，對(duì)于CAR-M的研究提供的作用有限。
2）巨噬細(xì)胞天然對(duì)常用的病毒載體具有抗性。巨噬細(xì)胞是人體抗擊癌細(xì)胞和病毒的第一道防線，因此可能會(huì)對(duì)常用的標(biāo)準(zhǔn)病毒載體產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致病毒載體無法高效感染巨噬細(xì)胞制備CAR-M，這是限制CAR-M療法開發(fā)的重大挑戰(zhàn)之一。且轉(zhuǎn)導(dǎo)后的CAR-M需要進(jìn)行陽性分選才能更好的進(jìn)行下游抗腫瘤功能驗(yàn)證。
目前深圳細(xì)胞谷對(duì)于CAR-NK和CAR-M的制備方面均有重大突破，隨時(shí)歡迎各位CGT領(lǐng)域前輩一起交流學(xué)習(xí)和蒞臨指導(dǎo)工作。
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