細胞治療中安全性開關的應用
患者在完成自體或異體細胞輸注后，大量免疫細胞被激活并快速增殖，引起IL-6、IL-1、IL-12、TNF-α、IFN-α、GM-CSF等細胞因子的過度級聯(lián)釋放，導致發(fā)生發(fā)熱、低血壓、毛細血管滲漏、缺氧和終末器官功能障礙等癥狀，也被稱為細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome, CRS)。為了應對患者在接受細胞治療后出現(xiàn)CRS，目前有兩種方法，一方面可以通過CRS和神經(jīng)毒性的預測性生物標志物來進行檢測，通過密集的監(jiān)測及時做出反應；另一方面是設計更加安全的細胞療法，而目前已經(jīng)達成共識的策略是給細胞裝上“安全開關”，在人為可控下進行治療，且在不良反應發(fā)生前及時踩剎車，將有助于減輕毒副作用。
隨著技術的發(fā)展，通過提供或去除小分子，提供基于蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑，或通過物理刺激，如光、超聲波或熱，對細胞產(chǎn)品進行可逆性控制已變得可行[1]。
二、安全性開關的類型
(一) 利用CID技術平臺
CID是化學誘導二聚化（Chemical Induced Dimerization），所謂的CID技術平臺（化學誘導的二聚體化技術）就是將特定DNA的分子導入靶細胞，使靶細胞表達CID蛋白(如FKBP12)和目的蛋白，再通過加入小分子化合物CID誘導使之發(fā)生二聚化，從而讓相應的CID蛋白發(fā)揮自身的功能。CID蛋白包括信號區(qū)域和結(jié)合區(qū)域，加入二聚誘導劑（如rimiducid）可以使之與CID結(jié)合區(qū)域結(jié)合成二聚物，二聚物就會開啟下游信號的級聯(lián)反應。
Caspase-9是細胞凋亡信號通路的啟動酶，激活后會產(chǎn)生信號級聯(lián)反應并最終導致細胞凋亡。在過繼性細胞治療中可以通過轉(zhuǎn)導iCasp9以此控制細胞的生命活動。iCasp9由CID蛋白序列通過linker與caspase9序列所組成（圖1 B），細胞當暴露于二聚化誘導藥物時，就會導致表達該結(jié)構的細胞快速死亡，減輕治療中的嚴重副作用。
有研究團隊創(chuàng)建了一種分子開關來調(diào)節(jié)CAR-T細胞的活性，只需要給予一種常用的抗癌藥物——來那度胺（lenalidomide）即可實現(xiàn)[3]。他們利用了一項被稱為靶向蛋白降解的新穎技術，包括來那度胺在內(nèi)的少數(shù)藥物可以通過該途徑靶向降解特定蛋白發(fā)揮作用。利用這一機制改造了小蛋白標簽，當這種降解標簽被貼在CAR上后，在施用來那度胺期間，來那度胺會結(jié)合到CAR結(jié)構的蛋白標簽上去，就會誘導CRL4CRBN介導的泛素化和蛋白酶體降解，被標記的CAR就會被降解，從而阻止T細胞識別癌細胞。由于T細胞還會不斷制造CAR蛋白，在撤除來那度胺后，新生成的CAR蛋白逐漸累積，CAR-T細胞恢復抗腫瘤功能。
圖2. 利用來那度胺調(diào)控CAR結(jié)構的降解[3]
簡單地說，四環(huán)素(Tet)調(diào)控表達系統(tǒng)就是通過誘導藥物如Tet改變調(diào)控蛋白質(zhì)的構象，從而控制目的蛋白的表達。在細菌系統(tǒng)中，正常情況下，四環(huán)素阻遏蛋白（tetR）將與四環(huán)素抗性操縱子（tetO）結(jié)合，抑制下游抗性基因tetA的轉(zhuǎn)錄。當存在四環(huán)素或者四環(huán)素類似物如強力霉素（Dox）時，tetR將與四環(huán)素結(jié)合，不再和tetO結(jié)合，造成下游抗性基因tetA表達，四環(huán)素就會通過tetA蛋白運出到細胞外，細菌從而獲得耐藥性[4]。
圖3. 大腸桿菌的四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)[4]
按照特點可以分為：激活性系統(tǒng)Tet-on和抑制型系統(tǒng)Tet-off。
Tet-off原理：tTA是由TetR和病毒轉(zhuǎn)錄激活域VP16融合而成的蛋白。當不存在Dox時， tTA和TRE（7個重復的TetO序列）結(jié)合，啟動下游基因表達；當存在Dox時，tTA的構象發(fā)生改變，tTA會TRE上脫落，從而導致下游基因表達關閉。
Tet-on原理：rtTA是由rTetR和VP16融合而成的蛋白，它的表型與tTA相反 。rtTA是一種反Tet阻遏物(rTetR)，并依賴四環(huán)素的存在進行誘導，而不是抑制。當Dox不存在時，rtTA不能結(jié)合TRE, 下游基因表達關閉。當存在Dox時，rtTA的構象發(fā)生改變，rtTA集合TRE，下游基因表達開啟。
可以利用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)做到對目的基因表達的精準調(diào)控，以此來控制細胞是否表達CAR結(jié)構或者調(diào)控細胞的死亡。
參考文獻
[1]Sahillioglu, A.C. and T.N. Schumacher, Safety switches for adoptive cell therapy. Curr Opin Immunol, 2022. 74: p. 190-198.
[2]Di Stasi, A., et al., Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med, 2011. 365(18): p. 1673-83.
[3]Jan, M., et al., Reversible ON- and OFF-switch chimeric antigen receptors controlled by lenalidomide. Sci Transl Med, 2021. 13(575).
[4]https://2013.igem.org/Team:Bielefeld-Germany/Biosafety/Biosafety System M.
