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多發(fā)性骨髓瘤的CAR-T治療研究進(jìn)展
一、CAR-T治療
CAR-T細(xì)胞免疫療法是一種新型的治療方法，它利用患者自身的免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗癌細(xì)胞，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)是將分離所采集的患者外周血中的T細(xì)胞，通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)使分離出的T細(xì)胞表達(dá)CAR，而后再將這些細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)進(jìn)行抗腫瘤治療。CAR由來(lái)自單克隆抗體的單鏈可變片段（scFv）、來(lái)自CD8的鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域四部分組成（圖1）。第一代CAR僅包含一個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域，第二代加入了共刺激結(jié)構(gòu)域如CD28或4-1BB等，以增強(qiáng)CAR-T的抗腫瘤效應(yīng)。第三代在第二代的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將共刺激結(jié)構(gòu)域增加至兩個(gè)，以促進(jìn)CAR-T的增殖和活化。第四代在第三代的基礎(chǔ)上又增加了細(xì)胞因子，以提高CAR-T對(duì)腫瘤的殺傷力。有研究者開(kāi)發(fā)了一種新型CAR構(gòu)建體，這種新一代 CD19 CAR 編碼來(lái)自白細(xì)胞介素（IL）-2受體β鏈（IL-2Rβ）的截短細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和 STAT3 結(jié)合酪氨酸-X-X-谷氨酰胺 （YXXQ） 基序，以及TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（CD3ζ）和共刺激（CD28） 結(jié)構(gòu)域，這被認(rèn)為是第五代CAR[2]，雖然這一概念目前處于探索階段，但與單獨(dú)表達(dá)CD28或4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR-T細(xì)胞相比，該構(gòu)建體在血液瘤和實(shí)體腫瘤模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的體內(nèi)持久性和抗腫瘤作用，為治療實(shí)體瘤帶來(lái)了希望。CAR-T輸注入患者體內(nèi)后，可以特異性識(shí)別并通過(guò)細(xì)胞溶解、釋放細(xì)胞因子和Fas/FasL三種途徑殺死表達(dá)特異性抗原的腫瘤細(xì)胞，且不受主要組織相容性復(fù)合體（Maior histocompatibility complex，MHC）的限制。
圖1 CAR結(jié)構(gòu)示意圖
二、MM CAR-T治療靶點(diǎn)
目前，B細(xì)胞成熟抗原（B cell maturationantigen，BCMA）、信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員F7(Signaling lymphocyte activation molecule familymember F7，SLAMF7)、G蛋白偶聯(lián)受體C類(lèi)第5組成員D（G protein-coupled receptor class C group 5member D，GPRC5D）等已被用作MM CAR-T治療的靶點(diǎn)。目前市面上共獲批3款靶向BCMA的CAR-T產(chǎn)品。其中BCMA CAR-T產(chǎn)品bb2121已于2021年3月被批準(zhǔn)上市，2022年2月另一項(xiàng)產(chǎn)品cilta-cel也被批準(zhǔn)上市，最新獲批上市的是由我國(guó)馴鹿/信達(dá)生物共同開(kāi)發(fā)的?？颂K注射液，其他幾種抗原的研究也在進(jìn)行中。
圖2 MM治療靶點(diǎn)
01 BCMA
BCMA是一種III型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族，在B細(xì)胞成熟末期表達(dá)上調(diào)，尤其是在漿細(xì)胞上選擇性表達(dá)，且在大多數(shù)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞上高水平表達(dá)，但在幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞及其他正常組織細(xì)胞上基本不表達(dá)。BCMA通過(guò)與B細(xì)胞活化因子（B cell activating factor，BAF）結(jié)合，激活NF-KB和MAPK/JNK通路調(diào)節(jié)長(zhǎng)壽漿細(xì)胞的存活，也可以通過(guò)結(jié)合增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）促進(jìn)骨髓微環(huán)境中MM細(xì)胞的增殖。
由藍(lán)鳥(niǎo)生物推進(jìn)的bb2121 是由含有 BCMA CAR的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-T產(chǎn)品，Raje等人[3]報(bào)告了一項(xiàng)bb2121治療復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤的研究。共有36例復(fù)發(fā)難治MM患者入組，其中有3位患者在輸注前因疾病退出研究。33名患者的總體緩解率為85%，其中45%的患者具有完全緩解（9%）或嚴(yán)格完全緩解（36%）。
此外，強(qiáng)生公司生產(chǎn)的cilta-cel是另一種靶向BCMA的CAR-T產(chǎn)品，與其他anti- BCMA CAR-T 療法不同的是，它直接針對(duì)兩個(gè)BCMA表位（VH1和VH2）提高了對(duì)表達(dá) BCMA 的細(xì)胞的親和力。Lin等研究人員[4]報(bào)告了患者輸注cilta-cel后的早期、深度和持久反應(yīng)。共有97名患者參與研究，患者在清淋5～7天后接受 0.75×106/kg cilta-cel單次輸注，ORR為97.9% （95% CI：92.7-99.7），其中 94.9%的患者達(dá)到了VGPR，82.5%的患者達(dá)到了sCR。在61例骨髓微小殘留?。∕RD）可評(píng)估的患者中，92%的患者M(jìn)RD呈陰性，其中44%的患者（27/61)MRD 陰性持續(xù)6個(gè)月以上，其持續(xù)MRD陰性≥6個(gè)月的患者的2年P(guān)FS率為91%；18%的患者 MRD陰性持續(xù)大于12個(gè)月。Anti-BCMA CAR-T 療法在 MM 治療中取得了令人滿(mǎn)意的臨床療效，RRMM 患者也可在anti-BCMA CAR-T 治療中顯著獲益，但這些產(chǎn)品同時(shí)也觀察到了較高的CRS和ICANS風(fēng)險(xiǎn)，如何進(jìn)一步提高產(chǎn)品的安全性和有效性仍是需要考慮的一個(gè)挑戰(zhàn)。
02 SLAMF7
SLAMF7又稱(chēng)CD319、CRACC、CSSLAMF71，是信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子（SLAM）家族的一員，在免疫細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在正常組織中，SLAMF7的表達(dá)局限于造血系統(tǒng)，包括NK細(xì)胞、部分T細(xì)胞和B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。在正常B細(xì)胞的生命周期中，SLAMF7在前B細(xì)胞和漿細(xì)胞中高表達(dá)，且在多發(fā)性骨髓瘤及意義不明的單克隆丙種球蛋白病和冒煙型骨髓瘤階段的惡性漿細(xì)胞中都高水平表達(dá)。有研究表明，在新診斷（ND）骨髓瘤的惡性漿細(xì)胞上均勻表達(dá)SLAMF7，并且在強(qiáng)化放化療后的復(fù)發(fā)性骨髓瘤中依然保留表達(dá)[5]，在其他正常人體組織中并沒(méi)有已知的SLAMF7表達(dá)，這個(gè)發(fā)現(xiàn)使得SLAMF7成為骨髓瘤CAR T細(xì)胞治療中一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。
03 GPRC5D
GPRC5D是一種跨膜受體蛋白，主要在漿細(xì)胞表面表達(dá)，與正常細(xì)胞相比，多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞中GPRC5D的表達(dá)水平顯著升高，因此被認(rèn)為是MM潛在的治療靶點(diǎn)之一。免疫組化顯示GPRC5D在惡性骨髓瘤細(xì)胞上普遍表達(dá)，與BCMA分布類(lèi)似但相互獨(dú)立，且在正常組織表達(dá)僅限于毛囊?；诖?，有研究人員設(shè)計(jì)了一種包含七種靶向GPRC5D的人類(lèi)scFvs的CAR-T[6]，可以根除異種移植MM小鼠模型中的MM細(xì)胞，并且使小鼠實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期存活，在注射GPRC5D-CAR-T后100天，小鼠保持100%的存活率，并且沒(méi)有出現(xiàn)脫發(fā)或皮膚損傷等副作用。這一研究結(jié)果為將GPRC5D作為MM免疫治療的重要臨床靶點(diǎn)提供了重要的臨床前證據(jù)。
三、雙靶點(diǎn)CAR-T
雖然MM患者接受CAR-T治療后初期反應(yīng)良好，但臨床研究發(fā)現(xiàn)患者因抗原逃逸而復(fù)發(fā)的比例也很高，這可能與CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)增和持久性不足、腫瘤相關(guān)抗原的丟失或下調(diào)，以及腫瘤微環(huán)境中存在的免疫抑制因子有關(guān)。由于現(xiàn)有的治療方法有限，多數(shù)復(fù)發(fā)患者預(yù)后很差。針對(duì)多個(gè)抗原受體開(kāi)發(fā)多靶點(diǎn)CAR-T被認(rèn)為是解決抗原逃逸問(wèn)題最顯著的解決方法，尤其是雙靶點(diǎn)CAR-T的開(kāi)發(fā)，如BCMA/CD19雙靶點(diǎn)CAR-T的臨床開(kāi)發(fā)。
從理論上講，雙特異性CAR-T細(xì)胞可以通過(guò)以下四種方式實(shí)現(xiàn)[7-9]：1）如圖3A，Cocktail/Sequential infusion，即單特異性CAR-T細(xì)胞聯(lián)合治療（也就是雞尾酒療法）。這種聯(lián)合治療的弊端是兩種不同靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)增速率不同，最終會(huì)導(dǎo)致兩種CAR-T細(xì)胞的比例失調(diào)，不能更好地清除腫瘤細(xì)胞；2）如圖3B，Co-transduction，即兩種病毒載體分別編碼一種單特異性CAR分子，再將這兩種病毒共同轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞形成雙特異性CAR-T細(xì)胞。但由于轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的不同，這種辦法構(gòu)成的CAR-T細(xì)胞上兩種CAR分子的比例是不均衡的，且也會(huì)出現(xiàn)T細(xì)胞上僅表達(dá)一種CAR分子的情況；3）如圖3C，Bicistronic CAR-T細(xì)胞，即使用一種病毒載體編碼兩個(gè)單特異性的CAR分子，使CAR-T細(xì)胞上有兩種CAR分子。這種方法構(gòu)建的雙特異性CAR-T細(xì)胞可以靶向兩種抗原且這兩種CAR分子的比例是相等的。但這種方法的弊端是病毒載體載量有限。病毒同時(shí)編碼兩個(gè)CAR分子的效率較低，導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞上CAR分子表達(dá)量較低且第二個(gè)CAR分子的表達(dá)可能不完整；4）如圖3D-E，Bivalent CAR-T細(xì)胞，即一個(gè)病毒編碼一個(gè)CAR分子，這一個(gè)CAR分子上含有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。Bivalent CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)又可以分為兩種形式：線(xiàn)性串聯(lián)（Tandem）或環(huán)狀（Loop）構(gòu)型。這兩種bivalent CAR是目前研究最火熱和應(yīng)用最多的雙特異性CAR-T細(xì)胞構(gòu)型。
圖3 雙靶點(diǎn)CAR設(shè)計(jì)示意圖
相較于傳統(tǒng)的蛋白酶體抑制劑、單克隆抗體和免疫調(diào)節(jié)劑等治療手段，CAR-T細(xì)胞療法具有更顯著的靶向性和更強(qiáng)的殺傷能力，使得患者的緩解程度及生存期得到持續(xù)改善。然而，由于腫瘤細(xì)胞免疫逃逸等問(wèn)題導(dǎo)致的復(fù)發(fā)仍然是研究人員面臨的巨大挑戰(zhàn)。目前，針對(duì)這一問(wèn)題，多靶點(diǎn)特別是雙靶點(diǎn)CAR-T的臨床研究已經(jīng)初見(jiàn)成效。相信隨著更多的研究和臨床試驗(yàn)的開(kāi)展，CAR-T細(xì)胞療法的安全性和有效性將進(jìn)一步提高，為多發(fā)性骨髓瘤患者帶來(lái)更多的希望。
目前深圳細(xì)胞谷中標(biāo)華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院《GMP級(jí)細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)制備》項(xiàng)目，為其提供基于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的anti-BCMA CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的工業(yè)化制備及其應(yīng)用臨床?？上部少R的是患者在接受CAR-T細(xì)胞治療后一個(gè)月就達(dá)到了非常好的部分緩解?；颊咭殉鲈簲?shù)月目前已達(dá)到完全緩解（CR），M蛋白含量目前已下降至0 g/L！??！歡迎感興趣的廣大讀者聯(lián)系深圳細(xì)胞谷進(jìn)行深入交流！
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